l
l Kollagén elektroforézis minta kisózás után.
Az enzimes extrakció azt jelenti, hogy az oldható kollagén és a savban oldódó kollagén extrahálása után bizonyos proteázokat, például kollagenázt, pepszint, papaint és kimotripszint hidrolizálni kell, hogy különböző enzimatikusan oldódó kollagéneket kapjunk. A felhasznált proteázokat főként 3 típusra osztják: állati proteázok (például tripszin, pepszin), növényi proteázok (például papain, bromelain) és mikrobiális proteázok (például alkalikus proteázok, semleges proteázok). A kollagén enzimatikus hidrolízisével kapcsolatos kutatások során a lúgos proteázt használják leginkább.
A kollagén korlátozott módon lebomlik, azaz a terminális peptid lehasad. Mivel a kollagén peptidláncok közötti kovalens kötések a molekuláris terminális peptidben lévő lizin vagy hidroxilizin kölcsönhatása révén jönnek létre, a terminális peptid lehasad. A tripla hélix szerkezetet tartalmazó fő rész híg szerves savakban oldható és extrahálható. Az enzimes kezelés hidrolizálhatja a kollagén fibrin terminális peptidjét, javíthatja a kollagén hozamát; és nem rombolja le a kollagén hármas hélix szerkezetét, és megőrzi tulajdonságait. Számos tényező befolyásolja az enzimkivonást, például az enzimkoncentráció, az enzim és a szubsztrát aránya, az enzimatikus hidrolízis ideje, az enzimatikus hidrolízis hőmérséklete, a pH-érték és az anyag-folyadék arány. A tényleges működés során a kollagén nagy részét enzimvegyületes módszerrel vonják ki, többet pedig pepszinnel, a szerves sav pedig többnyire ecetsav.
l Pepszinnel kivont kollagén elektroferogramja
A kollagén enzimatikus hidrolízisének folyamata főként egyenzimes hidrolízis módszerre és több enzimes hidrolízis módszerre oszlik. A multienzimatikus hidrolízis módszer tovább oszlik vegyes enzimes hidrolízis módszerre (például szarvasmarha tripszin, pronáz, bacillus proteáz keverve) és lépésről lépésre enzimatikus hidrolízis módszerre. Általában ki kell dolgozni a bőr kollagén enzimes extrakciójának specifikus kísérleti folyamatát és feltételeit. Kisebb molekulatömegű kollagénpolipeptidek előállításához általában több enzimes hidrolízist alkalmaznak. Az enzimolízis hatását befolyásoló fő tényezők az enzim típusa, a hozzáadott enzim mennyisége, az enzimolízis hőmérséklete, az enzimolízis ideje, a pH-érték és az anyag víz aránya. A kollagén aggregált enzimatikus extrakciójával nem csak az extrakciós idő lerövidíthető, hanem jó biológiai aktivitású kollagén is nyerhető, és a környezetszennyezés is csekély. A kollagént a közönséges proteáz nem könnyen hidrolizálja, de az állati kollagenáz feltörheti, a törött fragmenseket pedig a közönséges proteáz az automatikus denaturáció után hidrolizálhatja. A kollagén hidrolizálásához a pepszin pH 1.65-1.70 és hőmérséklet 37 fok.
Vannak, akik sertéscsontokat használnak nyersanyagként, és a proteáz enzimatikus hidrolízis-reakcióját használják a hagyományos ragasztógyártási eljárás helyettesítésére, valamint kísérleti kutatásokat végeznek a kollagén enzimatikus hidrolízis-reakciójával és az enzimatikus ragasztógyártási eljárással kapcsolatban. Az eredmények azt mutatták, hogy a pepszin volt a legmagasabb kollagénkivonási arány (46,14 százalék), ezt követi a tripszin (43,42 százalék), a semleges proteáz (30,14 százalék) és az alkalikus proteáz (21,15 százalék). A pepszin enzimatikus hidrolízis reakciójának fő befolyásoló tényezőit egyfaktoros és ortogonális kísérletekkel optimalizáltuk. A vizsgálati eredmények azt mutatják, hogy a pepszin extrakciójának optimális körülményei az 1 százalékos pepszin koncentráció, az enzimes hidrolízist 2,0 pH-n 48 órán keresztül végezzük, majd 10 százalékos (w/v) koncentrációjú NaCl-oldatban kisózzuk. ) 24 órán keresztül. A kollagén végső visszanyerési aránya 64,77 százalék, a kollagén kivonási aránya pedig 49,75 százalék volt. Vannak, akik pepszint is használtak sertésbőr kollagén kivonására, és négy különböző pepszin dózist (1 százalék, 2 százalék, 2,5 százalék, 3 százalék) hidrolizáltak mintavétellel és -vizsgálattal. sertés bőr kollagén és a bomlási folyamat pepszin hidrolízis sebességét, és végül a kivonási sebesség 2 százalékos pepszin dózis és 6-7h hidrolízis idő. maximális. Vannak, akik friss sertésbőrt használnak nyersanyagként, tripszinnel hidrolizálnak 50-52 fokos körülmények között, az enzimadagolás 5000:1 ~ 10000:1, a pH-érték 9, a reakció 2-3 h, a nyersanyag: víz Enzimes hidrolízis 1:2 körülmények között. Az eredmények azt mutatták, hogy az összes fehérje extrakciós sebessége 80 százalék vagy annál nagyobb.
l A tintahal bőrében lévő kollagén visszanyerési sebessége pepszin hatására változó hőmérsékleten.
Ha enzimatikus módszert használunk a kollagén kivonására, az extrakció körülményeit szigorúan ellenőrizni kell:
Először is, az enzim hatásidejének megfelelőnek kell lennie. Ha az idő túl rövid, a kollagén nem szabadul fel teljesen a kivonatba, ami befolyásolja az extrakció sebességét; Ha az enzim hatásideje túl hosszú, a kollagén túlzottan hidrolizálódik, ami túl sok keserű kis molekulájú oligopeptidet eredményez, ami nem csak az elválasztási és tisztítási hatékonyságot növeli. A nehézség a kollagén funkcionális tulajdonságait és biológiai aktivitását is befolyásolja.
Másodszor, az enzimatikus hidrolízis hőmérsékletének megfelelőnek kell lennie. Ha a hőmérséklet túl alacsony, az enzim hatása nem nyilvánvaló; ha a hőmérséklet túl magas, az az enzim inaktiválódását és a kollagén denaturálódását okozza. A jelentések szerint, ha a tápközeg pH-ja valamivel alacsonyabb a semlegesnél, a kollagén denaturációs hőmérséklete 40-41 fok, ha a tápközeg pH-ja savas, a kollagén denaturációs hőmérséklete 38-39 fok , és a halbőr kollagén denaturációs hőmérséklete 7-12 fokkal alacsonyabb, mint a sertésbőr kollagén denaturációs hőmérséklete. Ezért, ha az extrahált kollagénnek jó biológiai aktivitással kell rendelkeznie, az extrakciós hőmérsékletnek alacsonyabbnak kell lennie, mint a denaturálási hőmérséklet az extrakciós folyamat során.
Harmadszor, ki kell választani a megfelelő enzimet. Általában a szárazföldi emlősök szövetéből történő kollagén extrahálásakor ésszerű a pepszin alkalmazása az optimális hőmérsékleten történő extraháláshoz, de a vízi állatok, például halak esetében a kollagén denaturációs hőmérséklete alacsonyabb, mint a szárazföldi emlősöké. Ezért sok proteáz nem megfelelő, és a kollagén egyes funkcionális tulajdonságai és biológiai aktivitásai tönkremehet, ha az enzimek számára optimális hőmérsékleten extrahálják. A kollagén és polipeptidjei enzimatikus módszerekkel történő kinyerésével kapcsolatos kutatások főként állati bőrökből és melléktermékeikből folynak, és kevés beszámoló érkezett a kollagén és polipeptidjei állati csontokból történő enzimes kinyerésére.
